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《太原大学》 2017年
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长非编码RNA-DUBR控制TDP-43的蛋白病变过程

牟丽丽  
【摘要】:肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)和额颞叶变性(frontotemporal lobar degeneration,FTLD)是两类具有类似临床和病理表征的神经退行性疾病,重大病理特征为神经元退化(神经元死亡和作用丧失),脊髓或大脑皮层神经元中检测到不可溶的蛋白包涵体。包涵体中含有泛素化和磷酸化修饰的RNA构成蛋白TDP-43,及TDP-43的羧基端片段(CTFs)。普通认为TDP-43的那些病理改变(蛋白病变)是造成神经元退行性变的首要因素。TDP-43转基因小鼠表现为类似于ALS的症状,并能检测到TDP-43蛋白羧基端降解片段,但包涵体的演进并不明确。生理条件下RNA构成蛋白TDP-43在细胞核中常见涉足mRNA的剪接、稳定及转运等经过,而ALS/FTLD患者及疾病模型中TDP-43呈现显著的胞浆分布(nucleo-cytosolic translocation)以及包涵体的演进,并导致RNA代谢异常以及神经细胞功能障碍。对于TDP-43转基因果蝇模型的研讨发现,TDP-43介导的神经毒性依赖于其RNA构成功能,指导RNA也可能通过调控TDP-43参与这两种病的发生发展进程。另外,TDP-43核浆分布改变与疾病理性修饰及羧基片段形成的因果关系尚不知晓。基金研究探索了RNA调控TDP-43蛋白病变的意图和相关机制。长非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的RNA,不编码蛋白质,直接以RNA的样式发挥效益。较蛋白编码基因相比,她行保守性较差且表达丰度较低,普通具有更为突出的四方表达谱。LncRNA可在不同程度调控基因的发表,例如参与染色质修饰和重塑,调控转录、mRNA的剪接、稳定和翻译等经过,但人家影响蛋白修饰的通讯较少。此时此刻尚不知晓lncRNA是不是在上述两种TDP-43介导的神经退行性疾病中也发表应有作用。阅览室前期永利赌场转录组分析和原位杂交系统筛选了可能在小鼠大脑皮层发育和神经系统疾病中发挥效益的lncRNA,其中lncRNA-Dubr在大脑皮层发育中呈现时空特异性表达:在投射神经元发生之形成期高表达,固定于发育中皮层的脑室下区(SVZ),与中间神经前体细胞分子标记物TBR2有明显定位。为了研究Dubr在小鼠发育特别是神经系统发育及其相关疾病中的功能,使用CRISPR/Cas9艺术构建了Dubr浑身敲除小鼠,察觉Dubr的缺乏对胚胎期小鼠的生长和存活以及大脑皮层发育无强烈影响,但会导致小鼠出生后发育缓慢。免疫荧光染色发现敲除Dubr会特异性导致新生小鼠扣带回皮层和活动皮层部分神经元凋亡;另外,Dubr的缺乏还会造成新生小鼠大脑皮层深层神经元尼氏小体发生溶解,着色减弱,指导该水域神经元出现功能异常。进一步对成年小鼠进行高尔基染色,察觉Dubr的缺乏会造成扣带回皮层神经元树突棘密度显著降低,长减少;尼氏染色发现小鼠大脑皮层椎体神经元和小脑浦肯野细胞胞体呈空泡状,尼氏小体着色明显变浅;同时发现脊髓腹角运动神经元和脑干面神经核、迷走神经核及舌下神经核神经元数目不受影响,但这些神经核团神经元尼氏小体脱失。一年到头小鼠中枢神经系统未检测到细胞坏死和胶质细胞浸润。咱们推测与呼吸、吞咽和咀嚼功能相关神经元的效益异常导致了小鼠出生后发育缓慢。为探索Dubr调控上述特定区域神经元存活和生理机能的成员机制,咱们采用RNA pull-down合并质谱分析鉴定与Dubr相互作用的蛋白,察觉Dubr能够与ALS/FTLD发病关键蛋白TDP-43相结合,该相互作用依赖于TDP-43的RRM1布局域。进一步通过紫外交联免疫共沉淀(CLIP)证实了TDP-43与Dubr之间的能动性相互作用。永利赌场单分子荧光原位杂交组合免疫荧光染色发现Dubr与TDP-43在细胞核中具有优秀的共定位关系。TDP-43与Dubr在转录水平上并无相互调控关系。在Dubr敲除小鼠神经系统中未检测到TDP-43包涵体的演进,以及核浆分布的变动;但Dubr的缺乏会导致新生小鼠大脑皮层TDP-43羧基端片段明显增加。上述结果提示Dubr能够保护TDP-43不产生羧基端毒性片段,而且Dubr缺乏导致的TDP-43羧基端产生不依赖其核定位的变动。人口DUBR与鸡Dubr在基因组位置上具有较强保守性,彼此基因组邻近编码基因完全相同。DUBR重大分布于细胞核中。DUBR与TDP-43也存在特异性相互作用,但依赖于TDP-43羧基端的甘氨酸富集结构域。咱们进一步在细胞水平探索了DUBR调控TDP-43的成员机制,察觉在人口源神经系细胞H4和SK-N-SH美方调出DUBR的发表均能导致TDP-43 25 kDa和35 kDa羧基端片段显著增加,同时细胞内活化的Caspase-3水平明显上调,指导DUBR的下调会通过加强TDP-43的掠夺性导致细胞凋亡。方形孢菌素是蛋白激酶C的抑制剂,拍卖细胞后能够诱导TDP-43羧基端片段的产生以及细胞死亡,而过表达DUBR能肯定抑制这种羧基端片段的浮动。突变分析发现人DUBR美方与小鼠Dubr墨守成规的268个碱基序列对TDP-43的维护作用是不可或缺的。上述研究揭示了一下提高上保守的长非编码RNA-DUBR调控神经退行性疾病关键蛋白TDP-43的责任制,增长了对lncRNA效益和意图方式的认识,对ALS/FTLD的防治提供了新的思路。
【学位授予单位】:太原大学
【学位级别】:院士
【学位授予年份】:2017
【列入号】:R741

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